testing the test

Was ist ein PCR-Test?

Gesucht wird bei PCR mit sogenannten Primern. Davon gibt es immer 2, den Forward-Primer und den Reverse-Primer. Dies sind 20-40 Basen lange DNA-Einzelketten, also recht kurz. (Sucht man nach RNA, muß diese in der Probe erst nach DNA übersetzt werden. Die resultierende cDNA wird dann mit PCR untersucht).

DNA besteht bei Raumtemperatur aus einem Doppelstrang, der (außerhalb der Zelle) wenig reaktiv ist. Mit Hilfe des Enzymes DNA Polymerase (das P in PCR) wird DNA verdoppelt. Die Zelle tut dies bei der Zellteilung. Man hat danach 2 Doppelstränge.

Hier nun der PCR Zyklus: erhöht man die Temperatur teilt sich der Doppelstrang in 2 Einzelstränge. Jetzt können die Primer an den ihnen komplementären Stellen andocken. Und zwar der Forward-Primer an den einen Strang und der Reverse-Primer an den (komplementären) anderen Strang. An einem (sehr) kurzen Stück hat man jetzt jeweils wieder einen Doppelstrang bestehend aus Proben-Einzelstrang und Primer. Dieser Schritt entscheidet über die Spezifität von PCR. Docken die Primer an oder nicht?

Man kühlt nun die Probe ab und die DNA Polymerase verlängert jetzt diese kurzen Stücke entlang des jeweiligen Einzelstrang durch Einbau von Basen-Molekülen aus dem Medium. Man hat danach wieder 2 vollständige Doppelstränge. Jetzt kann man den Schritt (Zyklus) wiederholen, also die Temperatur wieder erhöhen, um den Doppelstrang zu teilen, Primer andocken lassen, abkühlen und Primer entlang der Einzelstränge verlängern usw., um 4 DNA Doppelstränge, 8, 16 usw. zu erzeugen (das CR in PCR – chain reaction).

Wie sensibel und wie störanfällig ist ein PCR-Test?

PCR ist ultra-sensitiv, d.h. es kann absurd niedrige Konzentrationen von DNA nachweisen. Andererseits ist es nur mäßig spezifisch, als dass PCR alles verstärkt an das die Primer andocken können. Das ist der Fluch der PCR Methode.

Hier spielt zum einen die Probenreinheit rein. Ist die zu untersuchende DNA ausreichend gereinigt, oder gibt es Reste von anderer DNA? Diese Reste können auch von benachbarten Spezies stammen, also hier von anderen Virenstämmen, die in der Probenpräparation nicht ausreichend entfernt worden sind. Zum anderen entscheidet über das Andocken der Primer nicht die Basenfolge der Primer alleine, obwohl dies ein wesentlicher Faktor ist, sondern die elektronische Struktur der Primer.

Es bedarf zudem eines sogenannten Goldstandards, d.h. einer von PCR unabhängigen Methode, um nachzuweisen, dass PCR das Richtige verstärkt. Das sind in der Regel serologische Tests, die allerdings bei Viren schwierig sind, da Viren teilweise schwer zu kultivieren und zu isolieren sind. Man ist deshalb in den letzten Jahren, auch mangels Alternativen, dazu übergegangen PCR zu seinem eigenen Goldstandard zu erklären. Das ist äußerst fragwürdig.

PCR ist dabei aber nicht so unspezifisch, dass es beliebige DNA Stränge verstärken kann, sondern es muß ein hinreichender Match mit den Primern bestehen. Schaut man mit anderen Primern in dieselbe Probe, wird (in der Regel) ein anderer DNA Strang verstärkt.

Meistens versucht man den Problemen dadurch auszuweichen, dass man mehrere unterschiedliche Primerpaare verwendet, die an unterschiedliche Stellen der zu untersuchenden DNA andocken sollen. Schwierig wird es, wenn sich in einer Probe pathogene (krankmachende) und harmlose Viren befinden, die ggfs. ähnliche Gensequenzen aufweisen. Waren die Primer ausreichend spezifisch oder gibt es Kreuzreaktionen der harmlosen Viren mit den Primern für die (mutmaßlich) gefährlichen Viren?

Hier hilft häufig nur die Vermutung. Fragt man bei den Herstellern nach, kriegt man in der Regel die Aussage, dass die gekauften Primer sehr, sehr spezifisch sind.

 4 Bemerkungen dazu:

Bemerkung 1: das Thema Kreuzreaktionen in PCR Tests geht in der Regel unter, da die meisten Veröffentlichungen dazu von den Herstellern selbst stammen. Das ist seit 20 Jahren so. Und es ist besonders schlimm bei den von der WHO empfohlenen PCR Protokollen. Die WHO scheint von dem Wort Kreuzreaktion noch nie gehört zu haben. Das gibt es dort praktisch nicht.

Bemerkung 2: PCR kann nicht erkennen, ob Viren durch Antikörper neutralisiert sind. Ebenfalls kann PCR nicht erkennen, ob es sich um reproduzierfähige Viren handelt. In der Regel sind es auch nur Bruchstücke des Virengenoms, die durch PCR verstärkt werden.

Bemerkung 3: ob man mit PCR etwas findet oder nicht hat nichts mit der Frage zu tun, ob die betreffende Spezies, zu der die untersuchte DNA(RNA) gehört, ursächlich für die Krankheit ist.

Bemerkung 4: PCR Diagnostik ist ein Milliarden-Markt.